Bisa ular mengandung enzim yang menghidrolisis ikatan karboksil ester.Substrat untuk hidrolisis adalah fosfolipid, asetilkolin dan asetat aromatik.Enzim ini meliputi tiga jenis: fosfolipase, asetilkolinesterase dan esterase aromatik.Arginine esterase dalam racun ular juga dapat menghidrolisis arginin atau lisin sintetis, tetapi terutama menghidrolisis ikatan protein peptida di alam, sehingga termasuk dalam protease.Enzim yang dibahas di sini hanya bekerja pada substrat ester dan tidak dapat bekerja pada ikatan peptida apa pun.Di antara enzim-enzim ini, fungsi biologis asetilkolinesterase dan fosfolipase lebih penting dan telah dipelajari sepenuhnya.Beberapa racun ular memiliki aktivitas esterase aromatik yang kuat, yang dapat menghidrolisis p-nitrofenil etil ester, a – atau P-naftalena asetat dan indole etil ester.Masih belum diketahui apakah aktivitas ini dihasilkan oleh enzim independen atau efek samping karboksilesterase yang diketahui, apalagi signifikansi biologisnya.Ketika racun Agkistrodon halys Japonicus direaksikan dengan p-nitrophenyl ethyl ester dan indole ethyl ester, hidrolisat p-nitrophenol dan indole phenol tidak ditemukan;Sebaliknya, jika ester ini bereaksi dengan racun ular subspesies cobra Zhoushan dan racun ular Bungarus multicinctus, mereka akan cepat terhidrolisis.Diketahui bahwa racun kobra ini memiliki aktivitas kolinesterase yang kuat, yang mungkin bertanggung jawab untuk hidrolisis substrat di atas.Bahkan, Mclean et al.(1971) melaporkan bahwa banyak racun ular dari keluarga Cobra dapat menghidrolisis indole ethyl ester, naphthalene ethyl ester dan butyl naphthalene ester.Racun ular ini berasal dari: kobra, kobra leher hitam, kobra bibir hitam, kobra emas, kobra mesir, king kobra, mamba kobra emas, mamba hitam dan mamba bibir putih (D.aw masih mengenal ular derik rhombola timur
Racun ular dapat menghidrolisis metil indole etil ester yang merupakan substrat untuk menentukan aktivitas kolinesterase dalam serum, tetapi bisa ular ini tidak menunjukkan aktivitas kolinesterase.Hal ini menunjukkan adanya esterase yang tidak diketahui pada racun ular kobra, yang berbeda dengan kolinesterase.Untuk memahami sifat enzim ini, diperlukan kerja pemisahan lebih lanjut.
1. Fosfolipase A2
(I) Ikhtisar
Phospholipase adalah enzim yang dapat menghidrolisis gliseril fosfat.Fosfolipase di alam ada 5 macam, yaitu fosfolipase A2 dan fosfolipase
A. , fosfolipase B, fosfolipase C dan fosfolipase D. Bisa ular terutama mengandung fosfolipase A2 (PLA2), beberapa bisa ular mengandung fosfolipase B, dan fosfolipase lainnya terutama ditemukan di jaringan hewan dan bakteri.Gambar 3-11-4 menunjukkan tempat kerja fosfolipase ini pada hidrolisis substrat.
Di antara fosfolipase, PLA2 telah dipelajari lebih banyak.Ini mungkin enzim yang paling banyak dipelajari dalam bisa ular.Substratnya adalah ikatan ester pada posisi kedua Sn-3-gliserofosfat.Enzim ini banyak ditemukan dalam racun ular, racun lebah, racun kalajengking dan jaringan hewan, dan PLA2 berlimpah dalam empat keluarga bisa ular.Karena enzim ini memecah sel darah merah dan menyebabkan hemolisis, disebut juga “hemolisin”.Beberapa orang juga menyebut PLA2 hemolytic lecithinase.
Ludeeke pertama kali menemukan bahwa bisa ular dapat menghasilkan senyawa hemolitik dengan bekerja pada lesitin melalui enzim.Belakangan, Delezenne et al.membuktikan bahwa ketika racun kobra bekerja pada serum atau kuning telur kuda, itu membentuk zat hemolitik.Sekarang diketahui bahwa PLA2 dapat langsung bekerja pada fosfolipid membran eritrosit, menghancurkan struktur membran eritrosit dan menyebabkan hemolisis langsung;Ini juga dapat bekerja pada serum atau lesitin tambahan untuk menghasilkan lesitin hemolitik, yang bekerja pada sel darah merah untuk menghasilkan hemolisis tidak langsung.Meskipun PLA2 melimpah di empat famili bisa ular, kandungan enzim dalam berbagai bisa ular sedikit berbeda.ular berbisa (C
Racun ular hanya menunjukkan aktivitas PLA2 yang lemah.Tabel 3-11-11 mengilustrasikan perbandingan aktivitas PLA2 dari 10 racun utama ular berbisa di Cina.
Tabel 3-11-11 Perbandingan aktivitas fosfolipase VIII dari 10 bisa ular di Cina
Bisa ular
Pelepasan lemak
asam alifatik,
Cjumol/mg)
Aktivitas hemolitik CHU50/^ g * ml)
Bisa ular
Lepaskan asam lemak
(^raol/mg)
Aktivitas hemolitik “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
sebelas
Mikrosefalus ophis
lima koma satu nol
kalyspallas
8. 68
dua ribu delapan ratus
gracilis
V, akut
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tiga koma delapan dua
seratus empat puluh
Bnugarus fasctatus
7,56
dua ratus delapan puluh
B.multicinctus
satu koma sembilan enam
dua ratus delapan puluh
Viper a russelli
tujuh koma nol tiga
T, mukrosquamatus
satu koma delapan lima
Siamensis
T.stejnegeri
0.97
（2） Pemisahan dan pemurnian
Kandungan PLA2 pada bisa ular besar, dan stabil terhadap panas, asam, alkali dan denaturan, sehingga mudah untuk memurnikan dan memisahkan PLA2.Metode yang umum adalah pertama melakukan filtrasi gel pada racun kasar, kemudian melakukan kromatografi penukar ion, dan langkah selanjutnya dapat diulang.Perlu dicatat bahwa pengeringan beku PLA2 setelah kromatografi penukar ion tidak boleh menyebabkan agregasi, karena proses pengeringan beku sering meningkatkan kekuatan ion dalam sistem, yang merupakan faktor penting yang menyebabkan agregasi PLA2.Selain metode umum di atas, metode berikut juga telah diadopsi: ① Wells et al.② Substrat analog PLA2 digunakan sebagai ligan untuk kromatografi afinitas.Ligan ini dapat berikatan dengan PLA2 dalam bisa ular dengan Ca2+.EDTA banyak digunakan sebagai eluen.Setelah Ca2+ dihilangkan, afinitas antara PLA2 dan ligan berkurang, dan dapat dipisahkan dari ligan.Lainnya menggunakan 30% larutan organik atau 6mol/L urea sebagai eluen.③ Kromatografi hidrofobik dilakukan dengan PheiiylSephar0SeCL-4B untuk menghilangkan jejak PLA2 dalam kardiotoksin.④ Antibodi anti PLA2 digunakan sebagai ligan untuk melakukan kromatografi afinitas pada PLA2.
Sejauh ini, PLAZ bisa ular dalam jumlah besar telah dimurnikan.Tu dkk.(1977) terdaftar PLA2 dimurnikan dari bisa ular sebelum tahun 1975. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak artikel tentang pemisahan dan pemurnian PLA2 telah dilaporkan setiap tahun.Di sini, kami fokus pada pemisahan dan pemurnian PLA oleh para sarjana Tiongkok.
Chen Yuancong dkk.(1981) memisahkan tiga spesies PLA2 dari racun Agkistrodon halys Pallas di Zhejiang, yang dapat dibagi menjadi PLA2 asam, netral, dan basa menurut titik isoelektriknya.Menurut toksisitasnya, PLA2 netral lebih beracun, yang telah diidentifikasi sebagai neurotoxin presinaptik Agkistrodotoxin.PLA2 basa kurang beracun, dan PLA2 asam hampir tidak beracun.Wu Xiangfu dkk.(1984) membandingkan karakteristik tiga PLA2, termasuk berat molekul, komposisi asam amino, N-terminal, titik isoelektrik, stabilitas termal, aktivitas enzim, toksisitas dan aktivitas hemolitik.Hasilnya menunjukkan bahwa mereka memiliki berat molekul dan stabilitas termal yang serupa, tetapi memiliki perbedaan yang signifikan dalam aspek lain.Pada aspek aktivitas enzim, aktivitas enzim asam lebih tinggi daripada aktivitas enzim basa;Efek hemolitik enzim alkali pada sel darah merah tikus adalah yang terkuat, diikuti oleh enzim netral, dan enzim asam hampir tidak mengalami hemolisis.Oleh karena itu, diperkirakan bahwa efek hemolitik dari PLAZ terkait dengan muatan molekul PLA2.Zhang Jingkang dkk.(1981) telah membuat kristal Agkistrodotoxin.Tu Guangliang dkk.(1983) melaporkan bahwa PLA beracun dengan titik isoelektrik 7,6 diisolasi dan dimurnikan dari racun Vipera rotundus dari Fujian, dan sifat fisik dan kimianya, komposisi asam amino dan urutan 22 residu asam amino di N -terminal ditentukan.Li Yuesheng dkk.(1985) mengisolasi dan memurnikan PLA2 lain dari racun Viper rotundus di Fujian.Subunit dari PLA2 * adalah 13 800, titik isoelektriknya adalah 10,4, dan aktivitas spesifiknya adalah 35/xnioI/miri mg。 Dengan lesitin sebagai substrat, pH optimal enzim adalah 8,0 dan suhu optimal adalah 65 ° C LD5 disuntikkan secara intravena pada tikus.Ini adalah 0,5 ± 0,12 mg / kg.Enzim ini memiliki efek antikoagulan dan hemolitik yang jelas.Molekul PLA2 beracun terdiri dari 123 residu dari 18 jenis asam amino.Molekulnya kaya akan sistein (14), asam aspartat (14) dan glisin (12), tetapi hanya mengandung satu metionin, dan N-terminalnya adalah residu serin.Dibandingkan dengan PLA2 yang diisolasi oleh Tuguang, berat molekul dan jumlah residu asam amino dari kedua isoenzim sangat mirip, dan komposisi asam amino juga sangat mirip, tetapi jumlah residu asam aspartat dan prolin agak berbeda.Racun ular kobra raja Guangxi mengandung PLA2 yang kaya.Shu Yuyan dkk.(1989) mengisolasi PLA2 dari racun, yang memiliki aktivitas spesifik 3,6 kali lebih tinggi dari racun aslinya, berat molekul 13000, komposisi residu asam amino 122, titik isoelektrik 8,9, dan stabilitas termal yang baik.Dari pengamatan mikroskop elektron terhadap efek PLA2 dasar pada sel darah merah, terlihat bahwa ia memiliki efek yang jelas pada membran sel darah merah manusia, tetapi tidak memiliki efek yang jelas pada sel darah merah kambing.PLA2 ini memiliki efek retardasi yang jelas pada kecepatan elektroforesis sel darah merah pada manusia, kambing, kelinci, dan marmut.Chen dkk.Enzim ini dapat menghambat agregasi trombosit yang diinduksi oleh ADP, kolagen dan asam natrium arakidonat.Ketika konsentrasi PLA2 adalah 10/xg/ml~lOOjug/ml, agregasi platelet benar-benar dihambat.Jika trombosit yang dicuci digunakan sebagai bahan, PLA2 tidak dapat menghambat agregasi pada konsentrasi 20Mg/ml.Aspirin adalah penghambat siklooksigenase, yang dapat menghambat efek PLA2 pada trombosit.PLA2 dapat menghambat agregasi trombosit dengan menghidrolisis asam arakidonat untuk mensintesis tromboksan A2.Konformasi larutan PLA2 yang diproduksi oleh racun Agkistrodon halys Pallas di Provinsi Zhejiang dipelajari melalui dichroism melingkar, fluoresensi dan penyerapan UV.Hasil percobaan menunjukkan bahwa konformasi rantai utama enzim ini mirip dengan enzim sejenis dari spesies dan genera lain, konformasi kerangka memiliki ketahanan panas yang baik, dan perubahan struktural dalam lingkungan asam bersifat reversibel.Kombinasi aktivator Ca2+ dan enzim tidak mempengaruhi lingkungan residu triptofan, sedangkan inhibitor Zn2+ sebaliknya.Cara di mana nilai pH larutan mempengaruhi aktivitas enzim berbeda dari reagen di atas.
Dalam proses pemurnian PLA2 dari bisa ular, fenomena yang jelas adalah bahwa racun ular mengandung dua atau lebih puncak elusi PLA2.Fenomena ini dapat dijelaskan sebagai berikut: ① karena adanya isozim;② Satu jenis PLA2 dipolimerisasi menjadi berbagai campuran PLA2 dengan berbagai berat molekul, yang sebagian besar berkisar antara 9.000~40.000;③ Kombinasi PLA2 dan komponen racun ular lainnya memperumit PLA2;④ Karena ikatan amida dalam PLA2 dihidrolisis, muatannya berubah.① Dan ② adalah umum, dengan hanya beberapa pengecualian, seperti PLA2 dalam racun ular CrWa/w
Ada dua situasi: ① dan ②.Kondisi ketiga telah ditemukan di PLA2 dalam racun ular berikut: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, viper Palestina, viper pasir, dan ular derik yang mengerikan km。
Hasil kasus ④ membuat kecepatan migrasi PLA2 berubah selama elektroforesis, tetapi komposisi asam amino tidak berubah.Peptida dapat dipecah dengan hidrolisis, tetapi umumnya mereka masih terikat oleh ikatan disulfida.Racun ular derik lubang timur mengandung dua bentuk PLA2, masing-masing disebut tipe a dan tipe p PLA2.Perbedaan kedua jenis PLA2 ini hanya satu asam amino, yaitu glutamin pada satu molekul PLA2 digantikan oleh asam glutamat pada molekul PLA2 lainnya.Meskipun alasan pasti untuk perbedaan ini tidak jelas, secara umum diyakini bahwa hal itu terkait dengan deaminasi PLA2.Jika PLA2 dalam racun ular berbisa Palestina tetap hangat dengan racun mentah, kelompok akhir dalam molekul enzimnya akan menjadi lebih banyak dari sebelumnya.Dari C PLA2 yang diisolasi dari bisa ular memiliki dua terminal-N yang berbeda, dan berat molekulnya adalah 30000. Fenomena ini mungkin disebabkan oleh dimer asimetris PLA2, yang mirip dengan dimer simetris yang dibentuk oleh PLA2 dalam racun ular berbisa punggung berlian timur dan ular derik punggung berlian barat.Kobra Asia terdiri dari banyak subspesies, beberapa di antaranya tidak terlalu jelas klasifikasinya.Misalnya, apa yang dulu disebut subspesies Cobra Outer Caspian sekarang dikenal
Itu harus dikaitkan dengan Kobra Laut Kaspia Luar.Karena ada banyak subspesies dan mereka bercampur, komposisi bisa ular sangat bervariasi karena sumber yang berbeda, dan kandungan isozim PLA2 juga tinggi.Misalnya bisa ular kobra
Setidaknya 9 jenis isozim PLA2 dari spesies r ^ ll ditemukan, dan 7 jenis isozim PLA2 ditemukan dalam racun subspesies kobra Kaspia.Durkin dkk.(1981) mempelajari kandungan PLA2 dan jumlah isozim dalam bisa ular yang berbeda, termasuk 18 bisa ular kobra, 3 bisa mamba, 5 bisa ular berbisa, 16 bisa ular berbisa dan 3 bisa ular laut.Secara umum, aktivitas PLA2 racun kobra tinggi, dengan banyak isozim.Aktivitas PLA2 dan isozim racun viper sedang.Aktivitas PLA2 racun mamba dan racun ular berbisa sangat rendah atau tidak ada aktivitas PLA2.Aktivitas PLA2 racun ular laut juga rendah.
Dalam beberapa tahun terakhir, belum dilaporkan bahwa PLA2 dalam bisa ular ada dalam bentuk dimer aktif, seperti ular derik rhombophora timur (bisa ular C. mengandung PLA2 tipe a dan tipe P, keduanya terdiri dari dua subunit identik. , dan hanya dimerase yang memiliki
Aktivitas.Shen dkk.juga mengusulkan bahwa hanya dimer PLA2 dari bisa ular yang merupakan bentuk aktif dari enzim.Studi struktur spasial juga membuktikan bahwa PLA2 ular derik punggung intan barat ada dalam bentuk dimer.Senyawa pemangsa
Ada dua PLA ^ Ei dan E2 yang berbeda dari bisa ular, di mana 仏 ada dalam bentuk dimer, dimer aktif, dan monomer terdisosiasinya tidak aktif.Lu Yinghua dkk.(1980) mempelajari lebih lanjut sifat fisik dan kimia serta kinetika reaksi E. Jayanthi et al.(1989) mengisolasi PLA2 dasar (VRVPL-V) dari racun viper.Berat molekul monomer PLA2 adalah 10.000, yang memiliki efek mematikan, antikoagulan, dan edema.Enzim dapat mempolimerisasi polimer dengan berat molekul berbeda di bawah kondisi PH 4,8, dan derajat polimerisasi dan berat molekul polimer meningkat dengan meningkatnya suhu.Berat molekul polimer yang dihasilkan pada 96 ° C adalah 53 100, dan aktivitas PLA2 polimer ini meningkat dua kali lipat
Waktu posting: Nov-18-2022